大家好，今天分享一篇2022年发表在NATURE COMMUNICATIONS上的文章，本研究专注于创建一种通用的等温核酸扩增方法，描述了用于分析算法的抽象模型，可以应用于短核酸序列miRNAs和病原体靶标(如高突变病毒)的多路检测。
随着检测非传染性或传染性疾病的复杂生物标志物的挑战日益严峻，核酸扩增已成为功能分子分析的基石。基于等温核酸扩增分析不依赖于PCR仪一类复杂的仪器，促使上述诊断朝着即时即地方向发展。
常见的例子包括基于发夹结构的扩增系统，例如交叉引物扩增(CPA)和环介导DNA扩增(LAMP)。在这些机制中，二级发夹作为一种自折叠结构，可以打开互补的目标双链(ds) DNA，暴露其引物位点，引发下一步的引物杂交和延伸。然而，这些方法增加了设计的复杂性，忽略了作为中间产物的反应单元；为了满足对分子的多样性检测，只能开发多种不同的检测方法。
因此，作者用一套基本的指导原则，将引物设计、扩增过程与功能性扩增中间体联系起来，设计了一种通用的、简化的酶介导等温扩增方法，提出了通过创建关键中间基序（功能发夹结构）来催化扩增反应的策略。
作者开发了基于DNA节点和电路的扩增方法，整个过程被简化为五个部分。如图1A所示：功能性发卡自折叠组装过程（实心箭头）；引物扩展过程（虚线箭头）；通过放大产生的功能性发夹（蓝色方框）；功能发卡自折叠产物（绿色三角形为正义链和绿色正方形为反义链）。整个过程围绕两个核心等温扩增反应进行，使用一个包含发夹基序（绿色三角形）的ssDNA，其在环区有一个引物结合位点，与环区互补的引物（图1A中电路S中的2a和电路A中的1s）与环区杂交时，启动延伸反应，用DNA链置换聚合酶打开发夹结构，茎上暴露的结构域（3s）作为起始位点，再次与引物结合进行延伸，产生双链产物，最后发生功能发夹自发的折叠拆卸反应（图1A的实箭头），又形成两个发卡，形成电路闭环，继续进行放大反应。图1A反应产生了长度有限的扩增子，图1D中较小的条带证实了这一点，并在图1C中通过测序证实。作者还证明了不同长度的环片段对反应动力学有着明显影响，其中环长度为40nt时，反应动力学较快（图1B）。
图2 引物设计软件流程图。包括（1）筛选目标序列（2）随机设计筛选US序列（3）根据四种不同方案过滤输出最终引物。
策略1：尾巴策略
如图3A所示，通过正向引物和反向引物合成一个通用尾巴(称为us)，其5’端具有相同的序列，3’端与特定的目标序列互补，产生一个功能性发夹基序（us+1s+2s+ua），然后通过DNA聚合酶进行引物延伸；另外还添加了两个外部引物（F3，B3），与在传统LAMP系统中使用的策略类似，增加了反应的动力学，达到指数放大的效果，图3B是分子反应过程的二级结构示意图。此方法可用于扩增病原体的序列，图3C证明其特殊结构的形成；图3D证实在无靶标的情况下不产生扩增子，有靶标的情况下才开始扩增。此方法也可以直接应用于短小序列的检测，并通过浓度依赖的方式（低至fM浓度）检测miR21 microRNA（图3E）。作者还检测了更广泛的miR-7家族，证明该方法能够从同一家族的其他成员中检测低浓度的miR-7-a（图3G）。
策略2：递进模型
当将额外的反应途径连接到主要途径时一般会出现复杂性的增加，例如EXPAR中扩增途径的一个产物作为第二个反应的输入。作者提出的第二种策略就是用来克服这种复杂性增加。利用中间体作为不同反应途径之间的链接，设计了一个等温扩增体系，该体系含有一个与目标序列3端互补的正向引物（3a+1s），与目标单个序列互补的反向引物（2a、3a、4a和5a），生成三个不同的功能发夹，这些发卡都包含相同的基序（3a+1s+2s+3s）。引物延伸过程中，引物2a/3a+1s分别结合在正义链和反义链环区，延伸后导致发夹结构打开，暴露出其他引物结合位点。关键中间结构可形成渐进式模型，驱动指数放大过程，如发夹（3a+1s+2s+3s+4s+5s）有两种功能，既可以与引物2a/4a和2a/3a在电路S1中催化生成3a+1s+2s+3s+4s和3a+1s+2s+3s，也可与引物2a/5a在电路S1和电路A1上都产生一个新的拷贝，从而起到递进放大的效果。作者也评估了这个渐进模型的敏感性，如图5B所示，随着目标浓度的增加，反应速度加快。图5C也证实，含有反义引物5a+4a和4a的系统比只使用引物3a的系统快，这是因为随着反义引物序列的引入，不同的扩增通路可被激活，有更多的机会形成更有功能的发夹，使反应动力学呈指数级变化。
图5 具有指数动力学的递进模型。
A 反应原理图。多个中间体形成（3a+1s+2s +3s, 3a+1s+2s+3s+4s, 3a+1s+2s+3s+ 5s）。
B 10倍连续稀释靶标的递进模型实时放大曲线:400 M结核细胞（红方）；40M结核细胞（蓝圈）；4M结核细胞（黄色三角形）；阴性对照（黑色三角形）。
C 实时检测引入不同反义引物体系的动力学:3a + 4a + 5a（蓝点）；3a + 4a（红线）；3a(黑色破折号)。阈值时间（Tt）为产生最大荧光强度20%的时间。
D 琼脂糖凝胶电泳显示不同数量的反义引物对反应的影响。lane1/2：3a + 4a + 5a；lane3/4：3a + 4a；lane5/6：3a。lane1/3/5用40M肺结核细胞；lane2/4/6是阴性对照。
Jonathan M. Cooper，格拉斯哥大学生物工程学教授和前副校长，获得ERC高级研究员奖。专注于在生命科学界面中使用微技术和纳米技术（特别是在高级诊断和芯片实验室领域）的研究。在Nature Communication、JACS、ACS nano等高水平杂志发表多篇成果。
Julien Reboud，格拉斯哥大学生物医学工程研究员，主要研究方向为微流体、声学、诊断。在Angewandte Chemie International Edition、lab on a chip、nano letters等高水平杂志发表多篇成果。
樊春海，上海交通大学化学化工学院客座教授，国家转化医学中心执行主任，中国科学院院士(CAS院士)，美国科学促进会(AAAS)、英国皇家化学学会(FRSC)、美国医学与生物工程学会(AIMBE)和国际电化学学会(ISE)的会员。ACS应用材料杂志副主编、ChemPlusChem编辑委员会联合主席。主要研究方向为双传感器、DNA纳米技术、生物光子，在同行评审期刊上发表论文500余篇。
DOI: 10.1038/s41467-022-29628-3
投稿：韩小乐
编辑：吴优
审核：杨宇君
文章评论